Растениеводство 9 сентября 2022

Сосудистый бактериоз капусты — селекционная борьба

Сосудистый бактериоз капусты — селекционная борьба

Текст: Л. М. Поддымкина, доц.; Д. А. Царев, ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева

Сосудистый бактериоз — распространенное заболевание крестоцветных, наносящее существенный ущерб посевам белокочанной капусты каждый год. Ввиду сложности борьбы с ним необходим поиск новых эффективных методов и средств противодействия, в том числе селекционных.

Данное заболевание имеет бактериальную природу, поэтому бороться с ним крайне затруднительно из-за малого количество антибактериальных препаратов на рынке, а также опасности их применения на регулярной основе, поскольку возможна потенциальная выработка резистентности у возбудителя. В подобных обстоятельствах наиболее эффективным решением является создание устойчивых сортов.

ТЕХНОЛОГИЯ ФИКСАЦИИ

Селекционный вариант противодействия сосудистому бактериозу сопряжен со множеством сложностей. В частности, необходимы поиск донора гена устойчивости в естественной среде обитания и способа его переноса в целевой вид с сохранением свойств, а также закрепление путем беккроссов устойчивых растений с резистентными родителями. С целью изучения технологий интродукции и фиксации генов в культурах, а также оценки рынка устойчивых гибридов капусты и текущего состояния линий, находящихся в процессе интродукции, специалистами ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева были проведены исследования. Местом реализации эксперимента являлось ООО «Селекционная станция им. Н. Н. Тимофеева». Данная организация занимается семеноводством и реализацией семенного материала фермерским хозяйствам и агрохолдингам, селекцией конкурентоспособных F1 гибридов и сортов овощных культур, а также научными исследованиями в направлении создания новых семян.

Основная работа по интеграции генов устойчивости ведется на базе Xanthomonas campestris pv. campestris (далее — Xcc) как наиболее распространенного патовара — возбудителя сосудистого бактериоза капусты, способного поражать и другие виды крестоцветных. Локация развития патогена — сосудистая система растения, по которой происходит инфицирование. В процессе развития Xcc выделяет в окружающую среду экзополисахарид ксантан, накапливающийся и закупоривающий сосуды ксилемы. Подобные пробки препятствуют току воды и питательных веществ, тем самым вызывая нехватку жидкости в клетках паренхимы, что способствует образованию типичных симптомов — V-образных хлорозов с темными жилками. От места проникновения бактерий в растения по сосудистой системе возбудитель переходит в черешки листа, а затем в кочерыгу, вызывая некротизацию сосудистого кольца. Системное инфицирование способно вызвать задержки роста и гибель молодых побегов. Сосудистый бактериоз ослабляет растения, что увеличивает их поражаемость другими болезнями.

СТАБИЛИЗИРОВАТЬ НАСЛЕДОВАНИЕ

К сожалению, в случае с генами устойчивости к этому заболеванию прогресс ограничен не только сложностями со скрещиваниями, что сильно снижает скорость исследований, но и проблемами, возникшими с поведением подобных генов после переноса в другой вид. Сегодня полностью успешных работ по интрогрессии гена и стабилизации его наследования не обнаружено.

Для отбора растений капусты, которые будут участвовать в дальнейших скрещиваниях для закрепления гена (-ов) устойчивости, требуется проводить искусственное заражение возбудителем в целях оценки сопротивляемости к каждому из трех наиболее распространенных штаммов в связи с явно выраженным расщеплением при наследовании. При наличии сомнений в принадлежности штаммов к той или иной расе необходим анализ ПЦР. Следует отметить, что в разных трудах как по интеграции генов устойчивости, так и по геному возбудителя с созданием различных маркеров ПЦР используются штаммы, различающиеся по месту и обстоятельствам происхождения. По этой причине способность маркеров отличить расу может являться специфичной к региональным коллекциям штаммов. В связи с этим сначала следует выяснить, какие именно из существующих маркеров способны разделять имеющиеся в коллекции и применяемые в работе чистые культуры Xcc. При рядовом проведении ПЦР на бактериях, если не стоит цель реализации исследований повышенной точности, выделять ДНК из них не требуется. Также не оценивается количество микроорганизмов при добавлении в итоговую смесь для анализа в связи со сложностями измерения.

ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ

В ходе проведенных исследований растения, участвующие в оценке устойчивости, высаживались индивидуальным методом. Кассеты 8 × 8 обрабатывались фунгицидным протравителем ТМТД путем замачивания в течение 20–25 мин для противодействия большинству микозов. Затем они набивались торфом и проливались водой. После этого при помощи пинцета семена высаживались по одному в ячейку. Их количество для каждого гибрида зависело от нескольких факторов. При обычных условиях линия засевалась в четыре ряда — 32 растения. На контроле применялись два ряда — 16 экземпляров. Если семян не хватало на четыре ряда, но хватало на два, то засевались два ряда, то есть 16 штук. При условии недостатка посевного материала для двух рядов вносилось столько, сколько возможно. Метки с названиями линий ставились в начало секций. Если количество семян не было достаточным для двух рядов, в конце зоны высева размещалась пустая метка.

Высаженные кассеты.png

Уход за растениями заключался в регулярном поливе. Капуста — влаголюбивая культура, поэтому операция проводилась либо каждый день, либо через день в зависимости от сухости субстрата. Проверка осуществлялась ежесуточно. Через 30 дней выращивания кассеты перемещались в теплицу для проведения опытов в целях изоляции окружающих образцов от воздействия Xcc и ограничения его распространения.

ПРОЦЕДУРА ЗАРАЖЕНИЯ

В подобных исследованиях обычно применяются различные методики инокуляции, например опрыскивание инокулюмом в условиях контролируемых влажности и температуры, закрепление смоченной в растворе ваты на листе с помощью скрепок, проколы. В условиях данного эксперимента заражение сосудистым бактериозом осуществлялось бактериальными суспензиями с концентрацией 1 × 106 КОЕ/мл методом проколов. Использовались хирургические пинцеты Tissue 200 × 2,5 мм, которые перед моментом инокуляции были стерилизованы спиртом и прожжены несколько раз. Через неделю после данной операции культура была подкормлена аммофоской. Этого не рекомендуется делать ранее, чтобы не ставить образцы в выгодное положение по сопротивляемости внешним факторам.

На каждом растении, находящемся в достаточно развитом состоянии, маркером были подписаны три листа цифрами 1, 3, 4, соответствующие расам. В случае если листовых пластин, подходящих для инокуляции, было слишком мало, на одном из них проводилась линия и две половины подписывались как две разные расы в целях распознавания в день оценки. Для прокола острые концы пинцета обматывались ватой, что позволяло удержать заражающий состав и нанести его на опытные экземпляры. На каждом листе совершалось по 10 проколов или более таким образом, чтобы попасть в жилки. Если поверхность была маленькой или деформированной, допускалось нанесение пяти проколов и более. При размещении нумерации для двух рас зона на конце листа, где проходит линия деления, не повреждалась, чтобы избежать проблем, связанных с определением. По причине объема работ и длины светового дня инокуляцию пришлось проводить два дня подряд. Перед вторыми сутками был осуществлен повторный контроль концентратов инокулюмов в целях определения содержания бактерий в нем и при необходимости его корректировки.

Растение с тремя подписанными листьями.png

СРЕДСТВА АНАЛИЗА

Для учета растений были разработаны особая форма и шкала. Обследование проводилось двумя специалистами для согласования наблюдений и минимизации разногласий. Подготовленная форма позволила упростить последующую локализацию экземпляров, перспективных с точки зрения дальнейшей работы, а также получить несколько более точную статистику. Среди обстоятельств, влияющих на сбор данных, отмечались следующие: человеческий фактор, при посеве приводивший к неравномерности всходов, а при инокуляции — к пропуску некоторых листьев в процессе прокалывания, всхожесть, особенно в физиологически слабых линиях, состояние растений на момент заражения — слабые не были подписаны и обработаны. Кроме того, значимое воздействие оказывали физиологические особенности: спустя три недели после процедуры многие экземпляры сбросили нижние листья, что вызвало потерю информации по одной из проколотых рас, как правило, четвертой.

Визуализированная шкала пораженности.png

Пятибалльная шкала была разработана на месте в первый день учета в связи с отсутствием аналогичных данных в других работах на рассматриваемую тему. Кроме того, необходимость ее создания объясняется тем, что разные условия — температура, влажность — после инокуляции способны замедлять или ускорять проявление симптоматики, уникальной в каждом случае. В соответствии со шкалой при 0 баллов симптомы отсутствуют. Может наблюдаться легкое осветление листа в ближайших к проколам зонам, однако нет оснований, чтобы считать его хлорозом. При 1 балле возле мест повреждений присутствуют слабые пятна или одна небольшая черная жилка на лист, но при этом заболевание отсутствует. Заметные хлорозы отмечаются при 2 баллах, но суммарно они не закрывают свыше 15% листа. Допустимы черные жилки, но не больше трех штук на листовую пластину, не проходящие по центральной жилке. 3 балла — хлорозы существенны, но вместе не превышают 35% площади. Может присутствовать не более пяти черных жилок, некоторые проникают в центральную. При 4 баллах хлорозы покрывают существенную часть листа — примерно 35–50%. Незначительная часть края может быть отмершей, но ее доля не должна превышать 15% от всей длины. Объемное поражение отмечается при 5 баллах, когда более 50% площади листа хлоротично, имеется множество черных жилок, допустим любой уровень некротизации. Пометка «н» означает, что на листовой пластине возле проколов сформировались концентрические некрозы черно-серого цвета. Могут регистрироваться в разных количестве и размере. Отметка «а» указывает на то, что на листе была замечена антоциановая окраска различной степени интенсивности.

СБОР ДАННЫХ

Учет растений вынужденно проводился в течение двух рабочих дней, с промежутком между ними в сутки. В связи с температурой в теплице на протяжении последней недели перед учетом данный день простоя не должен был оказать влияния на результаты эксперимента.

Всего было обработано 53 линии с количеством растений от 1 до 32 штук в каждой. Число зависело от исходного объема посевного материала, поскольку некоторые линии были малоплодовиты и давали малую долю семян, прорастаемости, степени роста — сильно отставшие в развитии экземпляры имели маленькие листья и не могли быть обработаны в срок. Кроме того, в расчет принимался человеческий фактор, выраженный в вероятности пропустить слабую единицу. Как уже отмечалось, в процессе анализа устойчивости по пятибалльной шкале должно участвовать по крайней мере два человека, чтобы избежать занижения или завышения индивидуальных оценок путем согласования мнений. Среди 53 линий были 10 единичных растений, прошедших отбор предыдущего года и подвергнутых повторному заражению в целях получения дополнительных данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПО ЛИНИЯМ

По итогам исследования 2021 года предположительно иммунными считались экземпляры, получившие исключительно 0 баллов пораженности по всем протестированным расам. Такие растения отбирались без дополнительных решений. Устойчивыми были образцы, имеющие 0 или 1 балл по рассмотренным расам, при этом их количество с поражением на 1 балл не должно быть более одного. Отбор обусловлен числом рас, нанесенных на растение, и степенью инфицирования в рамках балла. Решение по принятию такого экземпляра в дальнейшую работу зависело от мнения куратора эксперимента, ведущего исследование интеграции генов. Предположительно устойчивыми считались образцы, получившие 0 или 1 балл по двум протестированным расам при условии потерянного листа с третьей рассмотренной расой. Количество листьев, пораженных на 1 балл, не должно быть более одного на растение. Подобные экземпляры могут не выбрасываться, а подвергаться повторному обследованию после дальнейшего роста и получения новых листьев. В результате, включая единичные образцы с такого вторичного тестирования, были обнаружены 9 предположительно иммунных растений, 2 из них — из единичных образцов. Кроме того, зарегистрированы 12 устойчивых экземпляров, 8 — в целом резистентных, только для отдельных вариантов, 23 — предположительно устойчивых.

Результаты устойчивости по линиям и отбору.png

Помимо данных для работы с линиями также был получен материал по особенностям различных штаммов. В итоге листья с четвертой расой терялись значительно чаще, чем с первой и третьей, однако о точной причине этого феномена сделать выводы невозможно. Антоцианоз проявлялся чаще при четвертой расе, а некротические пятна — при третьей. Первая раса показала себя как гораздо более агрессивная, зачастую вызывая поражение на 3–5 баллов, а четвертая — как пассивная, в подавляющем большинстве случаев приводящая к повреждению не более чем на 2 балла. Также были созданы описательные характеристики текущей реакции растений каждой обследованной линии на поражение Xcc в целом, если имелись отличительные черты формирующегося иммунитета к множественным расам. В целом результаты проведенных исследований можно считать удовлетворительными и достаточными для дальнейшей работы не только по закреплению генов устойчивости, но и по изучению особенностей возбудителя и его взаимодействия с хозяином.

Популярные статьи